对候选基因的表达以及表观遗传修饰进行多重分析，可能会有助于更好地理解神经病理性疼痛的复杂机制。在本研究中，我们发现部分坐骨神经结扎显著增加了脊髓中单核细胞趋化蛋白3（MCP - 3，也称为CCL7）的基因表达，总共涉及33541个基因，这种增加持续了4周。MCP - 3基因转录的增加伴随着MCP - 3启动子处组蛋白H3在赖氨酸27位点的三甲基化水平的降低。在部分坐骨神经结扎的白介素6基因敲除小鼠的脊髓中，观察到的与表观遗传修饰相关的MCP - 3表达增加几乎被消除。与这些发现一致的是，单次脊髓内注射白介素6重组蛋白显著增加了小鼠脊髓中MCP - 3信使RNA的水平，并降低了MCP - 3启动子处组蛋白H3在赖氨酸27位点的三甲基化水平。此外，C - C趋化因子受体2（CCR2）基因的缺失，该基因编码MCP - 3的受体，并没有影响部分坐骨神经结扎后脊髓中MCP - 3表达的加速。在部分坐骨神经结扎的小鼠的脊髓背角中，MCP - 3蛋白的显著增加持续了多达2周，主要出现在星形胶质细胞中，而不是小胶质细胞或神经元中。另一方面，部分坐骨神经结扎导致的脊髓中小胶质细胞和星形胶质细胞的增加在白介素6基因敲除小鼠中大多被消除。此外，小胶质细胞的这种增加几乎被CCR2基因缺失所消除，而星形胶质细胞的增加在缺乏CCR2基因的神经结扎小鼠中并未受到影响。我们还发现，无论是体内还是体外用MCP - 3处理都会导致小胶质细胞的强烈激活。在这些条件下，脊髓内注射MCP - 3抗体抑制了小鼠脊髓中小胶质细胞的增加以及神经损伤后的神经病理性疼痛样行为。通过功能性磁共振成像分析，我们证明单次脊髓内注射MCP - 3在与疼痛相关的大脑区域引起了信号强度的显著增加。这些发现表明，神经损伤后与白介素6依赖的MCP - 3启动子处表观遗传修饰相关的MCP - 3表达增加，主要在脊髓星形胶质细胞中，可能有助于促进脊髓中星形胶质细胞 - 小胶质细胞的相互作用，并且可能在神经病理性疼痛样状态中发挥关键作用。
展开剩余95%一、引言
神经病理性疼痛以自发性烧灼痛、痛觉过敏（对疼痛刺激的反应性疼痛加剧）和痛觉异常（由通常无害的刺激引起的疼痛）为特征，是在疼痛诊所中最难管理的疼痛类型。迄今为止，尽管已经创建了多种慢性疼痛动物模型来研究神经病理性疼痛的发展机制，但对于伴随持续脊髓可塑性和神经元适应性反应的神经病理性疼痛的维持机制尚未完全了解。解开神经病理性疼痛复杂机制的重要一步是进行多重分析，用于基因表达分析以及表观遗传修饰的研究，这些修饰可以在不改变遗传密码的情况下对基因表达进行持久控制。DNA 微阵列和染色质免疫沉淀（ChIP）研究可能是实现这一目的的有用工具。然而，迄今为止，几乎没有研究在持续神经病理性疼痛的动物模型中采用这种方法。
表观遗传修饰主要由组蛋白尾部修饰控制。组蛋白尾部的修饰会改变紧密的染色质结构，并改变调节蛋白能够接触 DNA 的程度。越来越多的证据表明，通过组蛋白修饰调节染色质结构可能在学习和记忆的背景下介导长期行为变化。这一观点令人着迷，因为类似的机制被用来在细胞水平上触发和存储长期记忆，例如在神经病理性疼痛下的脊髓可塑性和神经元适应性反应中。
在本研究中，我们首次发现，在部分坐骨神经结扎后，单核细胞趋化蛋白 3（MCP - 3，也称为 CCL7）的表达增加，并且与白介素 6（IL6）信号依赖的组蛋白修饰相关，这种增加促进了与脊髓中星形胶质细胞和小胶质细胞之间增强的相互作用相关的疼痛感觉。这种现象可能至少在一定程度上解释了神经病理性疼痛的复杂机制。
二、材料与方法
2.1 小鼠神经病理性疼痛模型
在本研究中，我们使用了雄性 ICR 小鼠、雄性 IL6 基因敲除小鼠、雄性 C - C 趋化因子受体 2（CCR2）基因敲除小鼠、它们的野生型 C57BL/6J 小鼠以及雄性蛋白激酶 C - θ（PKC - θ）基因敲除小鼠及其野生型小鼠。PKC - θ 基因敲除小鼠在 C57BL/6J 和 129Sv 的混合遗传背景下进行维持。我们按照先前描述的方法制作了部分坐骨神经结扎模型。为了评估对热刺激的敏感性，分别对小鼠的每只后爪使用热刺激装置（IITC）进行测试。为了量化对触觉刺激的敏感性，使用 von Frey 丝（北海岸医疗公司）测量对触觉刺激的爪子撤回反应。
2.2 DNA 微阵列
使用 RNeasy 脂质组织小柱试剂盒（Qiagen）制备脊髓的总 RNA。对于基于微阵列的表达分析，合成的互补 RNA 标记了青色 3，并与 G4122F 全小鼠基因组微阵列（Agilent Technologies）进行杂交。
2.3 西方印迹
解剖腰椎脊髓，并按照先前描述的方法制备蛋白质（细胞质部分）。对于免疫印迹检测，将硝酸纤维素膜在以下一抗中孵育：抗信号转导子和转录激活因子 3（STAT3）、抗磷酸化 STAT3（p - STAT3）和甘油醛 - 3 - 磷酸脱氢酶（GADPH）。然后孵育至二抗，并通过增强化学发光检测并用 Amersham Hyperfilm 曝光成像。
2.4 逆转录 - 聚合酶链反应的半定量分析和实时逆转录 - 聚合酶链反应的定量分析
使用 SV 总 RNA 分离系统（Promega）按照制造商的说明提取小鼠腰椎脊髓中的总 RNA。按照先前描述的方法，使用 1 mg 纯化的 RNA 制备第一链互补 DNA。每个基因都在含有合成引物的 PCR 溶液中扩增，引物如在线补充材料所述。
2.5 染色质免疫沉淀
按照先前描述的方法进行染色质免疫沉淀实验，并进行了少量修改。从小鼠脊髓中提取可溶性染色质，并与针对乙酰化组蛋白 H3（AcH3）、组蛋白 3 在 Lys4（H3K4me3）、Lys9（H3K9me3）和 Lys27（H3K27me3）处三甲基化的特异性抗体进行孵育。使用 Dynabeads Protein A（Invitrogen Dynal）收集免疫复合物，并通过异丙醇沉淀回收 DNA。如先前所述进行定量 PCR。
2.6 免疫组织化学
使用 3% 异氟醚将小鼠深度麻醉，并通过心脏灌注固定新鲜制备的 4% 甲醛。腰椎脊髓切片（10 mm）在室温下用封闭液孵育 1 h，然后在 4℃下用一抗孵育 48 h；抗体：抗 - MCP - 3、抗 - NeuN、抗 - 胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、抗 - Iba - 1。然后冲洗抗体，并在室温下用适当的二抗孵育 2 h。使用光学显微镜检测免疫标记的荧光，并对图像进行数字化处理。
2.7 热痛觉过敏和触觉痛觉异常
为了量化脊髓内注射 MCP - 3 和抗 MCP - 3 抗体后对热或触觉刺激的敏感性，分别使用热刺激装置或 von Frey 丝测量爪子的撤回反应。
2.8 功能性成像
使用连续功能性 MRI 扫描协议，使用 T2 加权血氧水平依赖对比度研究大脑信号强度的变化。使用 FEAT 软件包进行数据分析。
所有方法均在补充材料中有详细描述。
三、结果
3.1 部分坐骨神经结扎后 MCP - 3 基因表达显著增加
为了确定疼痛处理的关键调节因子，我们在部分坐骨神经结扎后 7 天，使用全基因组寡核苷酸微阵列对神经结扎小鼠脊髓的同侧进行基因表达分析。为了提高微阵列数据分析的准确性，我们从每组 3 只小鼠中制备 RNA 作为三个重复。然后我们提取了在所有三个重复中相对对照样本变化超过 2.0 倍的基因（图 1A 和 B）。在神经结扎和假手术小鼠中都能检测到的 33541 个基因中，部分坐骨神经结扎后 7 天，小鼠脊髓中单核细胞趋化蛋白 3（MCP - 3，一种 Cys - Cys 趋化因子）的基因表达水平显著增加（n = 3；图 1A 和 B）。另一方面，部分坐骨神经结扎在小鼠中引起了持续 4 周的神经病理性疼痛（n = 8；图 2A）。与 DNA 微阵列分析结果一致，本研究的逆转录 - PCR 实验表明，从神经结扎小鼠脊髓同侧获得的 MCP - 3 mRNA 表达在部分坐骨神经结扎后 1 天至 4 周显著增加（n = 4，1 天：P < 0.05；3 天：P < 0.01；5 - 28 天：P < 0.001 与假手术小鼠相比；图 2B）。神经结扎小鼠脊髓中另一种 Cys - Cys 亚家族趋化因子（MCP - 1 和 RANTES）的 mRNA 水平也显著增加，尽管增加幅度较小（n = 4，MCP - 1 5 天和 7 天：P < 0.05；RANTES 5 天：P < 0.05，7 天：P < 0.01 与假手术小鼠相比；图 2C 和 D）。此外，这种 MCP - 1 或 RANTES 的增强表达在神经损伤后 2 周内得到解决。
图 1. 神经结扎小鼠脊髓中基因表达的变化。（A）使用全基因组寡核苷酸微阵列进行基因表达分析。样本在部分坐骨神经结扎或假手术后 7 天准备。每一列显示对应于单独样本的相对表达（结扎组 n = 3，假手术组 n = 3）。表达水平以对数刻度表示；红色对应高表达，深绿色对应低表达（见左下角的颜色刻度）。（B）按增加幅度顺序排列的上调基因（相对于对照组增加 2.0 倍）。
图 2. 神经结扎后小鼠腰椎脊髓同侧疼痛阈值和 Cys - Cys 趋化因子及其相关转录因子 mRNA 表达的时间变化。（A）部分坐骨神经结扎后小鼠对热（上）或触觉刺激（下）的爪子撤回潜伏期的变化。每个点表示八只小鼠的平均值 ± 标准误（SEM）。**P < 0.01，***P < 0.001 与假手术小鼠相比。（B - D）神经结扎后小鼠腰椎脊髓同侧 Cys - Cys 趋化因子 mRNA 表达的变化。每个点代表四个样本的平均值 ± SEM。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001 与假手术小鼠相比。（E）神经结扎后小鼠脊髓中 STAT3 和 p - STAT3 水平的变化。每个点代表四个样本的平均值 ± SEM。**P < 0.01，***P < 0.001 与假手术小鼠相比。（F）神经结扎后小鼠脊髓中 PU.1 和 NFIL6 mRNA 表达的变化。每个点代表四个样本的平均值 ± SEM。*P < 0.05，**P < 0.01 与假手术小鼠相比。
3.2 白介素 6 信号在神经结扎小鼠脊髓中 MCP - 3 mRNA 表达增加中的作用
我们发现，在部分坐骨神经结扎后 1 - 7 天，小鼠背根神经节同侧的 IL6 mRNA 水平显著增加，而我们在相同的条件下并未在小鼠脊髓同侧检测到 IL6 mRNA 表达（n = 4，P < 0.001 与假手术小鼠相比；补充图 1）。人们普遍认为，IL6 与 gp130 的结合会诱导细胞膜中 janus 激酶 1 的激活，随后在细胞质中使 STAT3 在 Tyr705 处磷酸化。此外，IL6 刺激激活了 Ets 家族转录因子 PU.1，它调节巨噬细胞特异性基因表达。因此，我们假设神经损伤小鼠脊髓中 MCP - 3 mRNA 表达的增加可能伴随着小鼠背根神经节和/或脊髓中 IL6 的增加，以响应有害刺激。
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在 IL6 基因敲除小鼠中，部分坐骨神经结扎后脊髓中 MCP - 3、MCP - 1 和 RANTES mRNA 水平的增加在结扎后 7 天显著降低，如逆转录 - PCR 实验所示（n = 3，MCP - 3：P < 0.05；MCP - 1：P < 0.001；RANTES：P < 0.01 与神经结扎野生型小鼠相比；图 3A）。通过实时 PCR 实验进一步证实，与 IL6 基因敲除小鼠相比，野生型（C57BL/6）小鼠在部分坐骨神经结扎后脊髓中 MCP - 3 表达的增加更为显著（n = 3，P < 0.05 与神经结扎 IL6 基因敲除小鼠相比；图 3B）。此外，单次脊髓内注射重组 IL6 蛋白显著增加了 IL6 处理小鼠脊髓中 p - STAT3（n = 4，P < 0.001 与 PBS 处理的小鼠相比）的水平，但未增加 STAT3，且 PU.1 mRNA（n = 4，P < 0.01 与 PBS 处理的小鼠相比）的水平在注射后 3 天增加（补充图 2B 和 C）。此外，IL6 基因敲除小鼠在部分坐骨神经结扎后脊髓背角中 PU.1 mRNA 表达的增加几乎完全缺失（n = 3，P < 0.001 与神经结扎野生型小鼠相比；补充图 2D）。
图 3. 白介素 6 信号通路在神经病理性疼痛下小鼠脊髓中 MCP - 3 mRNA 表达中的作用。（A）比较野生型（野生）和 IL6 基因敲除（KO）小鼠在神经结扎后 7 天腰椎脊髓同侧 MCP - 3、MCP - 1 和 RANTES mRNA 的表达。每个柱子代表三个样本的平均值 ± SEM。**P < 0.01，***P < 0.001 与假手术野生型小鼠相比。#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001 与神经结扎野生型小鼠相比。（B）定量分析野生型和 IL6 基因敲除小鼠在神经结扎后 7 天腰椎脊髓同侧 MCP - 3 mRNA 的表达。左：荧光强度与 PCR 循环次数的放大图。右：每个柱子代表三个样本的平均值 ± SEM。**P < 0.01 与假手术野生型小鼠相比。#P < 0.05 与神经结扎野生型小鼠相比。WT = 野生型。IL6 = IL6 基因敲除。
3.3 部分坐骨神经结扎后 MCP - 3 启动子处白介素 6 依赖的长期组蛋白修饰
在本研究中，我们使用针对 AcH3、H3K4me3、H3K9me3 和 H3K27me3 的抗体进行染色质免疫沉淀实验，并使用实时 PCR 定量与修饰组蛋白相关的 DNA 量。如图 4A 所示，在手术后 7 天，假手术和神经结扎小鼠脊髓中 MCP - 1 或 RANTES 基因启动子区域的组蛋白乙酰化和三甲基化水平相似。同样，在 MCP - 3 基因启动子处，假手术和神经结扎小鼠之间 H3 乙酰化或 K4 和 K9 三甲基化水平没有差异（图 4A）。本研究的关键发现是，与假手术小鼠相比，部分坐骨神经结扎显著降低了神经结扎小鼠脊髓中 MCP - 3 启动子处的 H3K27me3（n = 3，P < 0.05 与假手术小鼠相比；图 4A）。此外，这些在神经结扎小鼠脊髓中 MCP - 3 启动子处的 H3K27me3 降低在神经结扎后持续了 4 周（n = 3，1 周：P < 0.01；2 周：P < 0.05；4 周：P < 0.01 与假手术小鼠相比；图 4B）。此外，在野生型小鼠脊髓中观察到的 MCP - 3 启动子处的表观遗传修饰在 IL6 基因敲除小鼠中并未出现（n = 3：图 4C）。与这些数据一致的是，单次脊髓内注射重组 IL6 蛋白在注射后 3 天显著降低了小鼠脊髓中 MCP - 3 启动子处 K27 三甲基化的水平（n = 3，P < 0.05 与 PBS 处理的小鼠相比；图 4D）。
图 4. 神经结扎后 MCP - 3 启动子处白介素 6 依赖的长期组蛋白修饰。（A）使用定量染色质免疫沉淀（qChIP）分析神经结扎 ICR 小鼠在神经结扎后 7 天腰椎脊髓中 MCP - 3、MCP - 1 和 RANTES 位点的乙酰化组蛋白 3（AcH3）和组蛋白 3 在赖氨酸 4（H3K4me3）、赖氨酸 9（H3K9me3）和赖氨酸 27（H3K27me3）处的三甲基化。（B）神经结扎 ICR 小鼠在神经结扎后 7 天腰椎脊髓中 MCP - 3 启动子处 AcH3、H3K4me3、H3K9me3 和 H3K27me3 的时间变化。（C 和 D）使用定量染色质免疫沉淀（qChIP）分析野生型/IL6 基因敲除（KO）小鼠在神经结扎后 7 天腰椎脊髓中 MCP - 3 启动子处 AcH3、H3K4me3、H3K9me3 和 H3K27me3 的表达（C）以及 IL6 处理小鼠在脊髓内注射后 3 天的表达（D）。（A - D）每个柱子代表三个样本的平均值 ± SEM。*P < 0.05，**P < 0.01 与假手术或 PBS 组相比。
3.4 神经结扎小鼠脊髓中 MCP - 3 的细胞分布
为了明确神经结扎小鼠脊髓中 MCP - 3 的细胞分布，使用抗 - MCP - 3 抗体对小鼠 L4 腰椎脊髓进行免疫染色，并与神经元和胶质细胞标记物进行双重染色。在假手术后 7 天，L4 腰椎脊髓背角同侧或对侧的 MCP - 3 免疫反应性较弱（图 5A）。与 DNA 微阵列和 PCR 分析结果一致，部分坐骨神经结扎在神经结扎后 7 天，与对侧相比，小鼠脊髓背角同侧的 MCP - 3 免疫反应性显著增加（图 5Bi）。这些在神经结扎后小鼠脊髓背角同侧增加的 MCP - 3 免疫反应性在神经损伤后持续了多达 2 周（图 5Bii）。在这些条件下，MCP - 3 免疫反应性与神经元核（NeuN；图 5C）、抗代谢型谷氨酸亚型 5 受体（mGluR5）不共定位，该受体主要位于脊髓背角 I 和 II 层的神经元中，PKC - θ 主要存在于 II 层的神经元中，或微管相关蛋白 2，广泛分布于神经树突和轴突末端（补充图 3C）。相比之下，神经结扎后 7 天小鼠脊髓背角中增加的 MCP - 3 免疫反应性与星形胶质细胞标记物 GFAP 高度共定位（图 5D），但与小胶质细胞标记物 Iba - 1（图 5E）不共定位。尽管部分坐骨神经结扎在神经结扎野生型小鼠脊髓背角同侧引起了 GFAP 免疫反应性的显著增加（图 5Fii），但这种在神经结扎野生型小鼠中观察到的 GFAP 免疫反应性增加在 IL6 基因敲除小鼠的相同区域被消除（图 5Gii），表明神经损伤后诱导的 MCP - 3 蛋白主要存在于 IL6 敏感的激活星形胶质细胞中。另一方面，单次脊髓内注射 IL6 使脊髓中小胶质细胞的 Iba - 1 免疫反应性显著增加（n = 3，P < 0.001 与 PBS 处理的小鼠相比；补充图 4A）。此外，IL6 基因敲除小鼠在神经损伤后脊髓中未检测到 Iba - 1 免疫反应性增加（补充图 4Eii）。
图 5. 神经结扎小鼠 L4 腰椎脊髓背角中 MCP - 3 的免疫荧光染色。（A 和 B）在神经损伤后 1 至 2 周，L4 脊髓背角同侧的 MCP - 3 免疫反应性增加。（C - E）神经结扎小鼠 L4 腰椎脊髓背角中 MCP - 3 的细胞分布。L4 腰椎脊髓背角的冠状切片用 MCP - 3 和 NeuN（C）、GFAP（D）或 Iba - 1（E）进行双重免疫染色。在神经结扎后 7 天，MCP - 3 免疫反应性（红色）似乎不与 NeuN -（C，绿色）或 Iba - 1 免疫反应性（E，绿色）在小鼠脊髓背角中共定位。MCP - 3 免疫反应性（红色）在神经结扎后 7 天与小鼠脊髓背角中的 GFAP 免疫反应性（D，绿色）高度共定位。（F 和 G）神经结扎野生型（WT）小鼠脊髓中增加的 GFAP 免疫反应性（Fii）在 IL6 基因敲除（KO）小鼠的相同区域在手术后 7 天被消除（Gii）。比例尺 = 50 mm。
3.5 MCP - 3/CCR2 信号在神经病理性疼痛下脊髓小胶质细胞或脊髓神经元激活中的作用
部分坐骨神经结扎或脊髓内注射 IL6 均显著增加了脊髓背角中 CCR2 mRNA 的表达（n = 4，结扎：P < 0.001 与假手术小鼠相比，IL6 注射：P < 0.001 与 PBS 处理的小鼠相比；补充图 5A 和 B）。此外，神经结扎后脊髓背角中 Iba - 1 免疫反应性的增加在 CCR2 基因敲除小鼠中几乎完全被消除（图 6Cii 和 Dii），而部分坐骨神经结扎在 CCR2 基因敲除和野生型小鼠的相同区域均引起了 GFAP 阳性星形胶质细胞的增加（图 6Aii 和 Bii）。我们进一步发现，单次脊髓内注射 MCP - 3（1 pmol）在注射后 3 小时和 1 天使小鼠脊髓中 Iba - 1 水平显著增加（n = 3，3 小时：P < 0.001；24 小时：P < 0.05 与生理盐水处理的小鼠相比；补充图 6Bi 和 Ci）。同样，从神经结扎小鼠脊髓同侧获得的 Iba - 1 表达增加在手术后 1 至 6 天重复脊髓内注射功能阻断性 MCP - 3 抗体后被显著抑制（n = 6，P < 0.05 与 IgG 处理的神经结扎小鼠同侧相比；补充图 7）。为了确定 MCP - 3 处理对纯化小鼠脊髓小胶质细胞的影响，我们使用特异性 Iba - 1 抗体对原代脊髓小胶质细胞培养物进行免疫组化染色。如补充图 8 所示，体外用 MCP - 3（100 ng/ml）处理 1 天可引起小胶质细胞的强烈激活，通过与正常培养基处理的细胞相比，检测到肥大和 Iba - 1 免疫反应性水平增加。通过与选择性 CCR2 拮抗剂 RS102895（10 mM）共同处理，可减轻纯化脊髓小胶质细胞在 MCP - 3 处理后的激活。另一方面，据报道，脊髓应用 MCP - 1（也是一种内源性 CCR2 - 配体）通过 CCR2 在背角神经元中产生 ERK 的激活，与中枢敏化密切相关。与该报告一致，我们证明脊髓内注射 MCP - 3 在注射后 3 小时和 1 天增加了小鼠脊髓背角中 p - ERK 的水平（n = 3，P < 0.05 与生理盐水处理的小鼠相比；补充图 6Bii 和 Cii）。
接下来，我们研究了在部分坐骨神经结扎后，脊髓小胶质细胞或脊髓神经元的激活是否可以引发脊髓中 MCP - 3 mRNA 表达的增加。在确认 CCR2 和 PKC - θ 基因敲除小鼠分别不表达 CCR2 和 PKC - θ mRNA 后，我们发现 CCR2 或 PKC - θ 基因的缺失并未影响神经损伤后脊髓中 MCP - 3 表达的加速。
图 6. MCP - 3/CCR2 信号在神经病理性疼痛下脊髓中星形胶质细胞和小胶质细胞之间的相互作用中起关键作用。（A - D）神经结扎野生型（WT）（A 和 C）和 CCR2 基因敲除（KO）小鼠（B 和 D）腰椎脊髓中 GFAP（A 和 B）和 Iba - 1（C 和 D）的免疫荧光染色。在神经结扎后 7 天，仅在野生型或 CCR2 基因敲除小鼠腰椎脊髓背角对侧检测到微弱的 GFAP -（Ai 和 Bi）或 Iba - 1 免疫反应性（Ci 和 Di）。在神经损伤后 7 天，脊髓背角同侧的 GFAP -（Aii）和 Iba - 1 免疫反应性（Cii）均增加。在神经损伤后 7 天，CCR2 基因敲除小鼠脊髓背角同侧的 Iba - 1 免疫反应性（Dii）被消除。比例尺 = 50 mm。
3.6 脊髓 MCP - 3 直接引起的疼痛信号
接下来的研究旨在调查在部分坐骨神经结扎诱导的神经病理性疼痛中，脊髓中 IL6 依赖的长期增强的 MCP - 3 产生是否可以直接导致疼痛的发展。单次脊髓内注射 MCP - 3（1 pmol）在注射后 3 小时至 2 天使正常小鼠处于疼痛状态（n = 6 - 10；图 7A 和补充图 6A）。重复脊髓内注射选择性 CCR2 拮抗剂 RS102895（100 ng/小鼠）显著抑制了单次脊髓内注射 MCP - 3 后由降低的热和触觉阈值检测到的疼痛状态（n = 6，方差分析，热阈值：P < 0.01，触觉阈值：P < 0.05 与生理盐水 - MCP - 3 处理的小鼠相比；图 7B）。从手术后第 1 天至第 7 天每天两次重复脊髓内注射 MCP - 3 抗体显著抑制了神经结扎后与神经病理性疼痛样状态相关的行为（n = 6，方差分析，触觉阈值：P < 0.05 与 IgG - MCP - 3 处理的小鼠相比；图 7C）。此外，从手术后第 7 天至第 15 天每天两次重复脊髓内注射 MCP - 3 抗体也显著逆转了神经结扎小鼠同侧降低的热阈值（n = 6，方差分析，P < 0.01 与结扎 - IgG 小鼠相比；补充图 10）。我们进一步证明，野生型小鼠在部分坐骨神经结扎诱导的神经病理性疼痛在 CCR2 基因敲除小鼠中显著抑制（n = 5，方差分析，热阈值：P < 0.001，触觉阈值：P < 0.001 与神经结扎野生型小鼠相比）。
此外，野生型小鼠在部分坐骨神经结扎后同侧降低的热和触觉阈值在 IL6 基因敲除小鼠中显著抑制（n = 7 - 8，方差分析，热阈值：P < 0.001，触觉阈值：P < 0.001 与神经结扎野生型小鼠相比）。基于这些发现，我们接下来检查了脊髓内源性 IL6 是否直接导致部分坐骨神经结扎诱导的神经病理性疼痛样状态的发展。单次脊髓内注射重组小鼠 IL6（1 pmol/小鼠）在正常小鼠中引起持续的疼痛状态（n = 6，方差分析，热阈值：P < 0.001，触觉阈值：P < 0.05 与生理盐水 - 车辆处理的小鼠相比）。重组小鼠 gp130/Fc 嵌合蛋白在 IL6 受体体上作用，以螯合内源性 IL6，是一种高效且特异性的内源性 IL6 抑制剂。在本研究中，由部分坐骨神经结扎（n = 6，方差分析，热阈值：P < 0.001，触觉阈值：P < 0.05 与 PBS - 结扎小鼠相比）或脊髓内注射 IL6（n = 6，方差分析，热阈值：P < 0.001，触觉阈值：P < 0.001 与 PBS - IL6 处理的小鼠相比）诱导的神经病理性疼痛样状态通过重复脊髓预注射 gp130/Fc 显著降低（补充图 12B 和 C）。我们还发现，脊髓应用外源性 IL6 诱导的疼痛状态在用 RS102895 重复处理的小鼠中显著降低（n = 6，方差分析，热阈值：P < 0.001，触觉阈值：P < 0.01 与生理盐水 - IL6 处理的小鼠相比）。
最后，为了进一步了解 MCP - 3 相关的神经病理性疼痛样状态在小鼠中的发展机制，我们尝试使用功能性 MRI 评估脊髓应用外源性 MCP - 3 是否可以促进与上行疼痛通路相关的若干大脑区域的神经活动。在本功能性 MRI 研究中，部分坐骨神经结扎后对小鼠后爪施加热刺激，引起小鼠体感皮层（P < 0.001 与假手术小鼠相比）、扣带回皮层（P < 0.01 与假手术小鼠相比）以及内侧（P < 0.01 与假手术小鼠相比）和外侧丘脑核（P < 0.05 与假手术小鼠相比）的小鼠血氧水平依赖信号强度显著增加（所有 n = 4；图 7D - G）。与神经病理性疼痛样刺激一致，脊髓应用外源性 MCP - 3 后对小鼠后爪施加热刺激，引起这些区域的小鼠信号活动显著增加（所有 n = 4，体感皮层：P < 0.01，扣带回皮层：P < 0.05，内侧丘脑核：P < 0.01，外侧丘脑核：P < 0.05 与 PBS 处理的小鼠相比；图 7H - K）。
图 7. MCP - 3 信号通路在小鼠脊髓中部分坐骨神经结扎诱导的神经病理性疼痛样状态中的作用。（A）单次脊髓内注射 MCP - 3 后小鼠对热（左）或触觉刺激（右）的爪子撤回潜伏期的变化。每个点表示 6 - 8 只小鼠的平均值 ± 标准误（SEM）。***P < 0.001 与 PBS 组相比。（B 和 C）重复脊髓（i.t.）预处理选择性 CCR2 拮抗剂 RS102895（B）或功能阻断性 MCP - 3 抗体（C）对小鼠在脊髓内注射 MCP - 3（B）或部分坐骨神经结扎（C）后热痛觉过敏（左）和触觉痛觉异常（右）的影响。（B）RS102895 在脊髓内注射前 1 小时和连续 3 天每天一次注射。在每次测试日最后一次脊髓内注射 RS102895 后 1 小时测量疼痛阈值。每个点代表六只小鼠的平均值 ± SEM。**P < 0.01，***P < 0.001 与生理盐水 - PBS 组相比，#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001 与生理盐水 - MCP - 3 组相比。（C）从手术后第 1 天至第 7 天每天两次（两次注射间隔 12 小时）脊髓内注射阻断抗体。在每次测试日最后一次脊髓内注射 MCP - 3 抗体后 2 小时测量疼痛阈值。每个点代表六只小鼠的平均值 ± SEM。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001 与假手术
IgG1 组相比。$P < 0.05 与结扎 - IgG1 组相比。（D - K）神经结扎后 7 天（D - G）或脊髓内注射 MCP - 3 后 3 小时（H - K）小鼠体感皮层（S1）（D 和 H）、扣带回皮层（CG）（E 和 I）以及内侧（mTH）（F 和 J）和外侧丘脑核（lTH）（G 和 K）中血氧水平依赖信号强度的变化。在部分坐骨神经结扎或脊髓内注射 MCP - 3（1 pmol/小鼠）后，对小鼠右后爪施加热刺激。左：代表性激活图（Z 统计图像）对应于小鼠的合成图像。右：部分坐骨神经结扎（D - G）或脊髓内注射 MCP - 3（H - K）在每个区域均引起血氧水平依赖信号的显著增加。每个柱子表示四只小鼠的平均值 ± SEM。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001 与假手术或 PBS 组相比。
四、讨论
人们认为，长期的神经病理性疼痛可能是由于初级传入神经元和/或脊髓背角神经元的敏感性增加，随后促进上行疼痛传递到若干大脑区域，从而在神经损伤后产生脊髓可塑性和神经元适应性反应。这些脊髓可塑性和神经元适应性反应被认为需要基因表达的多样化改变。本研究的新颖之处在于识别了神经损伤后的长期 DNA 修饰。在 33541 个小鼠基因中，MCP - 3 的表达在神经结扎后变化最为显著。实际上，其增加幅度几乎是其他分子（如 MCP - 1）的四到五倍，而 MCP - 1 已经是神经病理性疼痛发病机制中的一个重要研究对象。此外，本研究结果清楚地表明，在神经结扎小鼠脊髓同侧，MCP - 3 的表达显著增加。本研究的关键点是 MCP - 3 增加的“持续时间”。我们在这里证明，MCP - 3 基因转录在神经损伤后显著加速了 4 周，而 MCP - 1 表达的增强在部分坐骨神经结扎后 2 周内得到解决。与部分坐骨神经结扎后 MCP - 3 mRNA 长期上调的逆转录 - PCR 实验结果一致，本研究的免疫组化分析显示，在部分坐骨神经结扎后 1 - 2 周，小鼠脊髓背角同侧的 MCP - 3 免疫反应性显著增加。据我们所知，本数据首次表明部分坐骨神经结扎在小鼠脊髓同侧引起了 MCP - 3 表达的显著且长期增加。
睫状神经营养因子家族的细胞因子包括 IL6、IL11、睫状神经营养因子、白血病抑制因子、肿瘤抑制因子 M、心养细胞因子 1 和心养细胞因子样细胞因子。在这一细胞因子家族中，已有研究表明，在外周神经损伤后，IL6 在损伤部位、背根神经节和脊髓中显著上调。此外，IL6 已被证明是外周组织中 Cys - Cys 亚家族趋化因子的强诱导剂。在本研究中，我们证明在部分坐骨神经结扎后 1 天和 7 天，小鼠背根神经节同侧的 IL6 mRNA 水平显著增加，而我们在相同的条件下并未在小鼠脊髓同侧明确检测到 IL6 mRNA 表达。此外，在 IL6 基因敲除小鼠中，部分坐骨神经结扎后脊髓中 MCP - 3 mRNA 表达的显著增加在结扎后 7 天显著降低。这些发现表明，神经损伤后 IL6 的增加对于脊髓中 MCP - 3 表达的增加至关重要。
最近有几项研究表明，脊髓中的胶质细胞是病理性疼痛诱导和维持的关键参与者。激活后，小胶质细胞和星形胶质细胞具有分泌可溶性介质（趋化因子、细胞因子和神经营养因子）的能力，这些介质可能有助于调节神经系统和免疫系统之间的相互作用。在本研究中，神经结扎后 7 天小鼠脊髓背角同侧增加的 MCP - 3 免疫反应性与星形胶质细胞标记物 GFAP 高度共定位，但与小胶质细胞标记物 Iba - 1 或神经元标记物不共定位。此外，神经结扎野生型小鼠脊髓背角同侧 GFAP 免疫反应性的显著增加在 IL6 基因敲除小鼠中被消除。这些发现表明，IL6 信号在脊髓中可能在部分坐骨神经损伤后通过激活脊髓同侧的星形胶质细胞，在促进 MCP - 3 产生中发挥关键作用。
越来越多的证据表明，IL6 下游转录因子（如 STAT3、NFIL6 和 PU.1）是调节多种与先天免疫相关的基因表达的关键调节因子，包括 IL1β、Toll 样受体 4 和 CD14。有趣的是，最近对 MCP - 3 基因的生物信息学分析预测，在 MCP - 3 启动子区域内存在这些转录因子的潜在结合位点。在本研究中，我们证明在手术后 1 - 3 天和 3 - 5 天，神经结扎小鼠腰椎脊髓同侧的 p - STAT3 水平和 PU.1 表达水平分别显著增加。与这些发现一致的是，单次脊髓内注射 IL6 后，脊髓背角中 p - STAT3 和 PU.1 mRNA 的水平显著增加。这些发现，连同 MCP - 3 启动子中 STAT3 和 PU.1 结合位点的邻近位置，使我们得出结论，这些转录因子可能是调节小鼠脊髓中神经病理性疼痛下 MCP - 3 表达的候选因子。
如上文所述，激活的 STAT3 和 PU.1 可以作为转录因子促进 MCP - 3 基因表达，那么为什么 MCP - 3 基因表达的长期增强与这些转录因子增加的持续时间之间存在差异呢？越来越多的证据表明，一些基因转录的长期改变伴随着启动子处的表观遗传修饰。这种表观遗传修饰主要由组蛋白尾部修饰控制。组蛋白尾部的修饰会改变紧密的染色质结构，并改变调节蛋白接触 DNA 的能力。组蛋白的乙酰化会减少组蛋白蛋白与 DNA 之间的静电相互作用，被认为可以放松染色质结构，使 DNA 更易于被转录调节因子接触。组蛋白甲基化特别复杂，它可以存在于单甲基化、二甲基化或三甲基化的状态，每种状态都可以招募独特的共调节因子，并对转录活性产生不同的影响。组蛋白甲基化也是独特的，因为每个赖氨酸残基都有不同的、通常是相反的对转录的影响。例如，H3K4me3 与基因激活高度相关，而 H3K9me3 或 H3K27me3 通常与基因抑制相关。在本研究中，我们清楚地发现，部分坐骨神经结扎在小鼠脊髓中引起了 IL6 依赖的 MCP - 3 启动子处 H3K27 三甲基化的显著且持续的降低。这种现象有助于放松 DNA 与组蛋白之间的结构相互作用，并增强 IL6 下游靶标 STAT3 和 PU.1 对 MCP - 3 启动子的接触，从而导致 MCP - 3 表达的长期增加。因此，我们的结果为与神经病理性疼痛相关的脊髓可塑性在 DNA 水平上的分子机制提供了新的见解。
有几条证据表明，CCR2（已被归类为单核细胞趋化蛋白的受体，包括 MCP - 3）在正常情况下不表达，但在外周神经损伤后在脊髓神经元和脊髓小胶质细胞中显著上调。与这些报告一致，我们发现，在部分坐骨神经结扎或脊髓注射 IL6 后，脊髓背角中 CCR2 mRNA 的表达显著增加。
特别有趣的是 MCP - 3/CCR2 信号依赖的脊髓小胶质细胞激活与部分坐骨神经结扎诱导的神经病理性疼痛的发病机制之间的直接相关性。在本研究中，我们发现脊髓应用外源性 MCP - 3 可引起正常小鼠的疼痛状态，并在注射后 3 小时和 1 天使脊髓中 Iba - 1 表达显著增加。同样，体外用 MCP - 3 处理可引起原代脊髓小胶质细胞培养物的强烈激活，通过检测肥大和 Iba - 1 免疫反应性水平增加来判断，主要通过在脊髓小胶质细胞上表达的 CCR2 实现。通过重复脊髓内注射功能阻断性 MCP - 3 抗体，可显著抑制神经结扎小鼠脊髓同侧 Iba - 1 表达的增加。我们还发现，神经结扎野生型小鼠脊髓背角同侧 Iba - 1 免疫反应性的显著增加在 CCR2 基因敲除小鼠中几乎完全被消除，而 CCR2 基因的缺失并未影响神经病理性疼痛下脊髓中 GFAP 阳性星形胶质细胞的增加。更重要的是，野生型小鼠在部分坐骨神经结扎后同侧降低的热和触觉阈值在 CCR2 基因敲除小鼠中显著降低。我们目前的研究结果得到了先前的研究结果的支持。在一项报告中，野生型小鼠在部分坐骨神经结扎后 30 天内脊髓背角同侧的驻留小胶质细胞的激活几乎完全被 CCR2 基因敲除小鼠消除。他们还清楚地表明，CCR2 与循环巨噬细胞进入小鼠脊髓实质有关，并且迁移细胞分化为激活的小胶质细胞。这些发现为部分坐骨神经结扎诱导的神经病理性疼痛的发病机制中，MCP - 3/CCR2 信号依赖的脊髓中星形胶质细胞和小胶质细胞之间的相互作用提供了关键证据。
有研究人员已经证明，脊髓应用 MCP - 1 可通过 CCR2 在背角神经元中产生 ERK 的激活，这与中枢敏化的诱导密切相关。与该报告一致，我们发现脊髓内注射外源性 MCP - 3 可在注射后 3 小时和 1 天增加小鼠脊髓背角中 p - ERK 的水平。尽管还需要进一步的研究，但这些结果支持了神经损伤后脊髓星形胶质细胞中诱导的 MCP - 3 可能通过在脊髓神经元上表达的 CCR2 受体，以及脊髓小胶质细胞，增强神经元的敏感性。
另一方面，有研究人员已经证明，PKC - θ 基因敲除小鼠对急性疼痛刺激表现出正常的反应，但在部分坐骨神经切断后几乎完全未能发展出神经病理性疼痛。在该报告中，他们还显示了 PKC - θ 在背角神经元中的限制性分布。此外，我们先前已经证明，坐骨神经结扎诱导的同侧超敏反应在 PKC - θ 基因敲除小鼠中显著降低。在本研究中，我们发现 PKC - θ 基因敲除小鼠在部分坐骨神经结扎后脊髓中 MCP - 3 mRNA 的增加水平没有变化。此外，在神经损伤后 7 天，神经结扎野生型和 CCR2 基因敲除小鼠之间 MCP - 3 mRNA 的水平没有差异。这些结果表明，在坐骨神经损伤后脊髓背角神经元和小胶质细胞激活之前，可在脊髓星形胶质细胞中观察到 MCP - 3 mRNA 表达的增加。
我们进一步研究了在部分坐骨神经结扎后，脊髓中 MCP - 3 表达的增加以及 MCP - 3 启动子处对 IL6 信号的表观遗传修饰是否可以直接导致神经损伤诱导的神经病理性疼痛的发展。单次脊髓内注射 MCP - 3 可在正常小鼠中引起疼痛状态。此外，从手术后第 1 天至第 7 天每天两次重复脊髓内注射特异性 MCP - 3 抗体或在脊髓内注射 MCP - 3 后 1 小时和连续 3 天每天一次注射选择性 CCR2 拮抗剂 RS102895 可显著抑制神经损伤或 MCP - 3 注射诱导的神经病理性疼痛样行为。有趣的是，从手术后第 7 天至第 15 天每天两次重复脊髓内注射 MCP - 3 抗体仍可有效逆转神经结扎小鼠的神经病理性疼痛样行为，表明阻断脊髓中 MCP - 3/CCR2 信号可能是缓解神经病理性疼痛的有效方法。我们还发现，通过重复脊髓预注射 gp130/Fc 可抑制神经损伤或单次脊髓内注射 IL6 在正常小鼠中诱导的神经病理性疼痛样状态。gp130/Fc 是一种二价同源二聚体，包含给定 gp130 的细胞外配体结合域，随后是人 IgG1 的铰链和 Fc 区域。这种受体嵌合蛋白在 IL6 受体体上作用，以螯合内源性 IL6，并且是一种高效且特异性的内源性 IL6 抑制剂。综合来看，这些发现首次提供了关键证据，表明在 IL6 信号响应下，MCP - 3 调控脊髓中星形胶质细胞与小胶质细胞之间的信号传导可能有助于与神经损伤诱导的神经病理性疼痛样状态相关的中枢敏化。
更好地理解激活的胶质细胞依赖的脊髓可塑性与大脑中与疼痛识别相关的加速活动之间的直接联系，可能为神经病理性疼痛的治疗铺平道路。本研究的另一个关键发现是，我们能够评估脊髓应用外源性 MCP - 3 是否可以促进与疼痛网络相关的若干大脑区域的神经活动。功能性 MRI 可用于研究大脑激活的空间和时间方面。功能性 MRI 已被用于客观评估健康人类和各种疼痛患者的中枢神经系统中的疼痛感知。最近有研究表明，神经影像学可在人类和动物中用于检测由诱导/调节疼痛的药物（如吗啡、氯胺酮、甲醛和辣椒素）引起的区域活动变化。此外，这些研究引入了药理学功能性 MRI 这一新概念，该技术有望成为对疼痛感兴趣的研究人员的重要新工具。我们先前已经证明，使用小鼠药理学功能性 MRI 实验证明，脊髓中蛋白激酶 C 的激活引起的神经病理性疼痛样传递可显著增加若干大脑区域的活动。在本研究中，我们证明脊髓应用外源性 MCP - 3 以及部分坐骨神经结扎后对小鼠后爪施加热刺激，可显著增加小鼠体感皮层、扣带回皮层以及内侧和外侧丘脑核的血氧水平依赖信号强度。由于皮层区域通过接收来自脊髓丘脑束的伤害性信息而被激活，神经影像学研究可能能够通过展示大脑回路来揭示其活动。扣带回皮层区域是疼痛的情感 - 动机成分，主要接收来自脊髓丘脑束的内侧系统的
信息。另一方面，体感皮层区域是疼痛的感觉 - 辨别成分，主要接收来自脊髓丘脑束的外侧系统的信息。内侧和外侧丘脑核也被归类为疼痛感知的中心，它们将感觉信息传递给这些皮层区域。综合来看，脊髓中 MCP - 3/CCR2 信号网络的激活在神经损伤后可能引起脊髓可塑性，进而导致向若干大脑区域的上行疼痛传递的敏化。
总之，我们证明在背根神经节激活后，小鼠脊髓同侧的星形胶质细胞中主要发生了对 IL6 信号响应的 MCP - 3 基因表达的显著且长期的增加。这种 MCP - 3 基因转录的长期增强是由于 MCP - 3 启动子处 H3K27 的三甲基化减少所致。这一现象可激活表达 CCR2 的脊髓小胶质细胞，进而可能促进与脊髓背角神经元和小胶质细胞之间相互作用的增强相关的疼痛感觉。尽管还需要进一步的分子实验，但我们在这里提出，重新设定神经损伤后伴随表观遗传抑制修饰的增强脊髓 MCP - 3 信号传导可能是神经病理性疼痛状态治疗干预的新靶点。
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